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指標(biāo)
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方法
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標(biāo)準(zhǔn)
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壯觀霉素、潮霉素B、雙氫鏈霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、慶大霉素、新霉素
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液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法
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GB/T 21323-2007 動物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測定
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技術(shù)原理
在LC-MS/MS方法中，樣品首先通過液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離，得到單一化合物的混合物。然后，分離后的化合物通過電離源進(jìn)行離子化處理，常用的電離源有電噴霧（ESI）和化學(xué)電離（APCI）。離子化后的化合物進(jìn)入質(zhì)譜儀，在那里它們按照質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行分析和檢測。通過質(zhì)譜檢測器得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，可以得到化合物的質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)以及相對含量等信息。
方法優(yōu)勢
高靈敏度與選擇性：LC-MS/MS能夠?qū)崿F(xiàn)極低濃度下的檢測，特別適合于復(fù)雜基質(zhì)中微量氨基糖苷類抗生素的分析。
強(qiáng)大的定性定量能力：質(zhì)譜提供分子量和結(jié)構(gòu)信息，有助于精確識別和量化目標(biāo)化合物，即使在復(fù)雜基質(zhì)中也能保持高準(zhǔn)確度。
降低基質(zhì)效應(yīng)：質(zhì)譜的高選擇性減少了基質(zhì)干擾，提升了分析的可靠性和重復(fù)性。
色譜柱選擇
HILIC RAC混合離子交換色譜柱：這種色譜柱以高純硅膠為基質(zhì)，提供獨(dú)特的反相、陰離子交換、陽離子交換等多重表面化學(xué)作用，適用于水溶性極性化合物的高效和高選擇性分離。它特別適用于氨基糖苷類化合物的測定，可以實(shí)現(xiàn)多種氨基糖苷的同時(shí)分析。
親水性色譜柱：這種色譜柱具有全新的保留機(jī)制，用于樣品的保留和分離，配合高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，可以建立快速有效的同時(shí)測定氨基糖苷類抗生素含量的方法。
C18色譜柱：C18色譜柱是一種常用的反相色譜柱，適用于多種化合物種類分析，包括氨基糖苷類抗生素。它具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，可以幫助解決氨基糖苷類抗生素的色譜分析問題。
Obelisc R色譜柱：這種色譜柱用于液相色譜流動相以及質(zhì)譜條件的優(yōu)化，對于氨基糖苷類抗生素的保留與分離能力表現(xiàn)出色，適用于多種氨基糖苷類抗生素的同時(shí)檢測。
流程概述
樣品前處理
1. 提?。簭膭游锝M織（如肌肉、肝臟）或植物材料（如谷物、蔬菜）中提取氨基糖苷類抗生素。常用的提取溶劑包括乙腈、甲醇、乙酸緩沖液等，根據(jù)目標(biāo)抗生素的特性選擇最合適的溶劑。
2. 凈化：提取后，樣品可能含有多種干擾物，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、色素等。使用固相萃?。?/span>SPE）或免疫親和層析等方法進(jìn)行凈化，以提高檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。
3. 濃縮與復(fù)溶：將凈化后的樣品進(jìn)行濃縮，然后用適宜的溶劑復(fù)溶，準(zhǔn)備上機(jī)分析。
液相色譜條件
1. 色譜柱：選擇適合氨基糖苷類抗生素分離的反相色譜柱，如C18柱。
2. 流動相：使用水相（含酸或緩沖液）和有機(jī)相（如甲醇或乙腈）的混合物作為流動相，根據(jù)目標(biāo)化合物的性質(zhì)調(diào)整比例和pH值。
3. 流速與梯度洗脫：設(shè)定適當(dāng)?shù)牧魉?，通常?/span>0.2-1 mL/min。采用梯度洗脫模式，以優(yōu)化分離效果。
質(zhì)譜條件
1. 電離模式：氨基糖苷類抗生素通常采用電噴霧電離（ESI）模式，正離子模式下檢測。
2. 多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）：選擇目標(biāo)化合物的母離子和子離子進(jìn)行監(jiān)測，以提高檢測的特異性和靈敏度。
數(shù)據(jù)分析
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建：使用標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定樣品中氨基糖苷類抗生素的濃度。
2. 定量分析：根據(jù)樣品中目標(biāo)化合物的響應(yīng)值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。
注意事項(xiàng)
1. 基質(zhì)效應(yīng)：動植物樣本基質(zhì)復(fù)雜，需關(guān)注基質(zhì)效應(yīng)，可通過內(nèi)標(biāo)法或基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行校正。
2. 回收率與精密度：定期檢查方法的回收率和精密度，確保檢測結(jié)果的可靠性。
3. 質(zhì)控與校準(zhǔn)：定期進(jìn)行儀器校準(zhǔn)和質(zhì)控，使用質(zhì)控樣品監(jiān)控分析過程中的穩(wěn)定性。
如何優(yōu)化檢測靈敏度
樣品前處理優(yōu)化
在樣品前處理過程中，控制上樣溶液的pH值至6~7是關(guān)鍵，因?yàn)椴煌被擒疹愃幬镌诓煌?/span>pH條件下的回收率有所不同。例如，STREP、DHSTREP、SPEC、HYGRO在酸性條件下回收率較低，而AMIK、KANA、APRA在堿性條件下回收率較低。因此，通過調(diào)整pH值，可以提高這些抗生素的回收率，進(jìn)而提高檢測靈敏度。
色譜條件優(yōu)化
選擇合適的色譜柱對于提高氨基糖苷類抗生素的檢測靈敏度至關(guān)重要。研究表明，Obelisc R色譜柱對10種氨基糖苷的分離效果最好，這是因?yàn)榘被擒疹愃幬餅閴A性化合物，在pH小于其pKa時(shí)，目標(biāo)物離子化，與SIELC Obelisc R鍵合的羧基相互作用，實(shí)現(xiàn)化合物的保留。相比之下，BEH Amide色譜柱由于酰氨基為中性基團(tuán)，離子交換作用較小，而BEH HILIC色譜柱上硅醇基與氨基糖苷類藥物之間存在強(qiáng)氫鍵作用和離子交換作用，導(dǎo)致峰寬較寬，峰形較差。
質(zhì)譜條件優(yōu)化
氨基糖苷類抗生素的結(jié)構(gòu)中含有多個羥基，極性很強(qiáng)，因此選擇電噴霧離子源。在正離子和負(fù)離子模式下，正離子模式的響應(yīng)通常高于負(fù)離子模式，這是因?yàn)榘被擒疹愇镔|(zhì)的結(jié)構(gòu)中含有多個伯胺或仲胺基團(tuán)，具有弱堿性，易被電離成正離子。在全掃描模式下，選擇化合物的分子離子峰，并在產(chǎn)物離子掃描模式下，以各個化合物的分子離子峰為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，選擇兩對豐度較強(qiáng)、基質(zhì)干擾較小的離子為子離子，以優(yōu)化質(zhì)譜條件。
基質(zhì)效應(yīng)考慮
在LC-MS/MS分析中，基質(zhì)效應(yīng)可能會影響檢測靈敏度。因此，需要選擇適當(dāng)?shù)娜軇┖蜅l件來最小化基質(zhì)效應(yīng)，確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
常見基質(zhì)效應(yīng)
基質(zhì)效應(yīng)的定義
基質(zhì)效應(yīng)是指在液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析過程中，樣品基質(zhì)中的成分對目標(biāo)分析物的信號產(chǎn)生影響的現(xiàn)象。這種影響可能表現(xiàn)為增強(qiáng)或抑制目標(biāo)分析物的響應(yīng)，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。
氨基糖苷類抗生素的基質(zhì)效應(yīng)
氨基糖苷類抗生素是一類具有高度親水性的化合物，它們含有多個氨基和羥基，因此在LC-MS/MS分析中容易受到基質(zhì)效應(yīng)的影響。常見的基質(zhì)效應(yīng)包括：
1. 離子抑制：氨基糖苷類抗生素在分析過程中可能會與樣品基質(zhì)中的其他離子發(fā)生競爭性吸附，導(dǎo)致分析物的信號減弱。
2. 離子增強(qiáng)：相反，某些情況下，樣品基質(zhì)中的離子可能會與分析物形成穩(wěn)定的離子對，從而增強(qiáng)分析物的信號。
3. 基質(zhì)效應(yīng)的選擇性：不同的基質(zhì)成分可能對不同的氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生不同程度的影響，這使得分析方法的普適性受到限制。
減少基質(zhì)效應(yīng)的策略
1. 樣品前處理：通過適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚砑夹g(shù)，如固相萃取（SPE）或液液萃?。?/span>LLE），可以去除或減少樣品基質(zhì)中的干擾物質(zhì)。
2. 選擇合適的色譜條件：使用離子對反相（RP）或親水相互作用（HILIC）色譜模式，以及3. 選擇合適的離子對試劑，可以改善分析物的分離和檢測。
3. 使用同位素稀釋法：通過向樣品中添加穩(wěn)定同位素標(biāo)記的分析物，可以校正基質(zhì)效應(yīng)帶來的誤差。
