植物內(nèi)源激素如生長素（IAA）、赤霉素（GA）、細胞分裂素（CKs）、脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）等，在植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，因此準(zhǔn)確測定這些激素的含量對于理解植物生理過程至關(guān)重要。在植物樣品中，激素含量通常很低，且植物體成分復(fù)雜，干擾組分多，這給激素的分析測定工作帶來了挑戰(zhàn)。
然而，LC-MS/MS技術(shù)能夠有效地解決這些問題。通過LC-MS/MS技術(shù)，可以對植物樣品中的植物內(nèi)源激素進行分離和定量分析。首先，使用液相色譜技術(shù)對樣品中的化合物進行分離，然后將分離得到的化合物進一步通過串聯(lián)質(zhì)譜進行檢測和定量。這種方法可以提高對植物內(nèi)源激素的靈敏度和準(zhǔn)確性。
獨特優(yōu)勢
高靈敏度：LC-MS/MS能夠檢測到低至皮克級別（pg/mL）的激素濃度，這對于植物激素這種通常存在于極微量的化合物來說尤為重要。
高選擇性：該技術(shù)能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的激素和代謝物，即使在復(fù)雜的植物基質(zhì)中也能準(zhǔn)確識別目標(biāo)植物激素，并排除其他干擾物質(zhì)。
高分辨率：LC-MS/MS能夠通過質(zhì)譜的高分辨率功能，準(zhǔn)確區(qū)分不同植物激素的同分異構(gòu)體或同系物，確保檢測結(jié)果的精準(zhǔn)性。
快速、自動化和高通量：LC-MS/MS技術(shù)可以實現(xiàn)對大量樣品的快速分析，提高實驗效率。同時，LC-MS/MS系統(tǒng)可以實現(xiàn)自動化操作，減少人為誤差，提高數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和可比性。
多通道檢測：一管血可同時檢測多種目標(biāo)化合物，這在多種激素檢測、多種維生素檢測、新生兒篩查、血藥濃度監(jiān)測等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。
樣品用量少、分析速度快、檢測范圍廣：與傳統(tǒng)檢測方法相比，LC-MS/MS方法具有樣品用量少、分析速度快、檢測范圍廣等優(yōu)點。
特異性好：LC-MS/MS方法對樣本進行干擾實驗的研究，通過色譜分離使干擾物質(zhì)在不同的時間出峰，可以有效的消除內(nèi)源性物質(zhì)、同分異構(gòu)體、其他代謝物的干擾，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
準(zhǔn)確度高：與傳統(tǒng)檢測方法比較，LC-MS/MS技術(shù)已成為目前生物樣品中小分子化合物定性、定量測定的金標(biāo)準(zhǔn)。其高準(zhǔn)確性和特異性，彌補了免疫分析法對小分子化合物檢測的缺陷。
基本步驟
樣品準(zhǔn)備：收集植物組織樣本，如葉片、根、花或果實，進行快速冷凍干燥或液氮冷凍保存以減少激素降解。隨后，使用適當(dāng)?shù)娜軇ㄈ缫译?、甲醇或含水有機溶劑混合物）提取激素。提取過程中可能需要加入內(nèi)標(biāo)物以校正樣品制備過程中的損失。
樣品凈化：提取液通過固相萃?。?/span>SPE）或免疫親和層析等技術(shù)進行凈化，以去除雜質(zhì)，提高目標(biāo)化合物的純度和回收率。
液相色譜分離：將凈化后的樣品注入液相色譜系統(tǒng)。利用不同類型的色譜柱（如反相C18柱）和流動相（如水和甲醇、乙腈的梯度洗脫），根據(jù)化合物的疏水性、極性等特性實現(xiàn)分離。
質(zhì)譜檢測：經(jīng)過色譜分離的組分進入質(zhì)譜儀，通過電噴霧離子化（ESI）或其他離子化方式形成離子。然后在質(zhì)譜中進行多級質(zhì)譜（MS/MS）分析，通過特定的母離子和子離子對進行選擇性監(jiān)測（SRM或MRM模式），以提高檢測的特異性和靈敏度。
數(shù)據(jù)分析：使用軟件處理LC-MS/MS數(shù)據(jù)，根據(jù)保留時間和特征離子比對標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)物進行定性和定量分析。
結(jié)果驗證：確保方法的準(zhǔn)確性、精密度和重復(fù)性符合要求。通常，通過分析標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)量控制樣品來評估方法性能。
如何提高準(zhǔn)確性和特異性
優(yōu)化樣品前處理：通過使用特定的溶劑混合物和溫度進行提取，可以有效地從植物組織中提取植物激素，同時減少其他次生代謝產(chǎn)物的干擾。例如，使用異丙醇、水和鹽酸的混合液在低溫下提取激素，并加入相應(yīng)的氘代內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，以便于后續(xù)的定量分析。
選擇合適的色譜柱和流動相：使用C18色譜柱和乙腈-0.1%乙酸水溶液作為流動相，可以實現(xiàn)植物激素的有效分離。梯度洗脫和適當(dāng)?shù)牧魉僭O(shè)置有助于縮短分析時間，同時保持良好的分離效果。
采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式：這種模式可以提高檢測的選擇性和靈敏度，因為它專門針對特定的植物激素離子對進行監(jiān)測，從而減少了其他物質(zhì)的干擾。
使用電噴霧電離源（ESI）：在負(fù)離子模式下進行分析，可以提高植物激素的檢測靈敏度，因為許多植物激素在負(fù)離子模式下更容易被檢測到。
內(nèi)標(biāo)法定量：通過使用與待測植物激素性質(zhì)相似的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，可以校正由于操作條件波動導(dǎo)致的分析誤差，提高結(jié)果的準(zhǔn)確度。
化學(xué)增敏策略：例如，通過化學(xué)移位術(shù)，可以在質(zhì)譜分析中有效檢測到原本無法檢測的植物激素，提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。
固相微萃取技術(shù)：雖然傳統(tǒng)的固相微萃取技術(shù)在植物樣品分析中存在一些局限性，但通過改進涂層材料或萃取模式，可以提高植物激素的富集率和分析的準(zhǔn)確性。
如何解決樣品的干擾問題
優(yōu)化樣品前處理：通過使用QuEChERS方法，可以減少基質(zhì)干擾，提高分離度，簡化操作，縮短分析時間，提高靈敏度和定量準(zhǔn)確性。
選擇合適的提取溶劑和凈化材料：研究表明，不同的提取溶劑和凈化材料對植物樣品中的激素提取效率有顯著影響。例如，甲醇、乙腈、0.1%氨水乙腈、1%乙酸乙腈等溶劑，以及PSA、C18凈化劑等材料，都需要經(jīng)過優(yōu)化以獲得最佳的提取和凈化效果。
使用高效液相色譜柱：選擇合適的色譜柱對于提高分離效率和減少干擾至關(guān)重要。例如，使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱進行分離，可以在短時間內(nèi)完成色譜分離，提高分析效率。
優(yōu)化質(zhì)譜條件：通過調(diào)整質(zhì)譜參數(shù)，如離子源電壓、碰撞能量等，可以提高目標(biāo)分析物的檢測靈敏度和選擇性，減少干擾。
使用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式：MRM模式可以提高分析的選擇性和靈敏度，減少背景噪聲，從而更有效地檢測和定量植物樣品中的激素。
建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和進行回收率實驗：通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和進行回收率實驗，可以評估方法的準(zhǔn)確性和可靠性，確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
樣品前處理減少基質(zhì)干擾
樣品均質(zhì)：首先，將植物樣品進行粉碎和均質(zhì)處理，以便于后續(xù)的提取過程。這一步驟有助于打破細胞壁，釋放出目標(biāo)化合物，同時減少基質(zhì)效應(yīng)。
提取分離：使用乙腈或酸化乙腈作為提取劑，通過振蕩法萃取植物樣品中的目標(biāo)化合物。在提取過程中，加入適量的鹽類（如硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸氫二鈉），以促進分層和提高提取效率。
凈化：提取液經(jīng)過凈化步驟，以去除基質(zhì)中的干擾物質(zhì)。這通常通過使用分散基質(zhì)固相萃?。?/span>d-SPE）技術(shù)實現(xiàn)，其中加入特定的吸附劑（如乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、石墨化碳黑（GCB）等）與基質(zhì)中的有機酸、脂肪酸、碳水化合物等干擾物結(jié)合，通過離心方式去除，從而達到凈化的目的。
濃縮：凈化后的上清液進行濃縮，通常使用氮吹或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除溶劑，以便于后續(xù)的分析檢測。
