基本原理
液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）是一種結(jié)合了液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度和選擇性質(zhì)量分析能力的技術(shù)。在測量動/植物中的有機酸時，首先通過液相色譜將樣品中的有機酸進行分離，然后利用質(zhì)譜對分離出的有機酸進行結(jié)構(gòu)分析，從而實現(xiàn)對有機酸的快速分離和精確定性/定量。
可檢測有機酸類型
液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）在檢測植物中的有機酸時表現(xiàn)出較高的靈敏度。這種技術(shù)可以用于測定多種植物源性食品中的有機酸物質(zhì)，包括但不限于富馬酸、反式-烏頭酸、己二酸、沒食子酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸、水楊酸、2,5-二羥基苯甲酸和3,4-二羥基苯甲酸等。此外，該方法還可以用于檢測酒類產(chǎn)品中的10種有機酸，如乙酸、草酸、丙二酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸、馬來酸、乙醇酸、富馬酸等。
LC-MS/MS法的優(yōu)點在于其操作簡捷、靈敏度高、分析速度快，可以滿足多種植物源性樣品中有機酸物質(zhì)的定性定量分析。該方法能夠?qū)⒛繕宋锱c其他雜質(zhì)組分的色譜峰實現(xiàn)良好的分離，在0.1~5.0 ug/mL的濃度范圍內(nèi)建立標準曲線，線性關(guān)系良好。此外，該方法的檢測限（LOD）和定量限（LOQ）非常低，分別為0.0003~0.010 ug/mL和0.001~0.033 ug/mL，這意味著即使是極微量的有機酸也能夠被檢測出來。
技術(shù)優(yōu)勢
液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）相對于傳統(tǒng)色譜法，主要優(yōu)勢體現(xiàn)在以下幾個方面：
高靈敏度和選擇性：LC-MS/MS能夠通過至少兩個物理特征（母離子和產(chǎn)物離子質(zhì)量）來識別分析物，這使得它對于許多分析物具有優(yōu)異的選擇性。此外，軟電離技術(shù)的引入使得低分子量分子可以在液相中電離，從而實現(xiàn)與液相色譜的有效耦合。
高通量和自動化：LC-MS/MS系統(tǒng)通常配備有先進的自動進樣和數(shù)據(jù)處理軟件，能夠快速處理大量樣本，大大提高了分析效率和重復(fù)性。
結(jié)構(gòu)信息豐富：除了能夠提供定量分析外，LC-MS/MS還能夠提供關(guān)于化合物結(jié)構(gòu)的詳細信息，如分子量和可能的結(jié)構(gòu)式，這對于未知化合物的鑒定和已知化合物的確認非常有用。
樣品準備簡單：與傳統(tǒng)色譜法相比，LC-MS/MS通常不需要復(fù)雜的樣品前處理步驟，如衍生化或化學修飾，這簡化了實驗流程并減少了潛在的誤差。
適用范圍廣：LC-MS/MS可以用于分析各種類型的化合物，包括極性和非極性化合物，這使得它在化學、生物學、環(huán)境科學和醫(yī)學等多個領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。
流程概述
1. 樣品采集與前處理
a. 樣品采集
從動物或植物組織中精確稱取一定量的樣本。
確保樣本新鮮或正確儲存，避免有機酸降解。
b. 樣品制備
研磨: 將樣品冷凍干燥后研磨成粉末。
提取: 使用合適的溶劑（如甲醇、乙腈或水）進行提取。提取過程可能需要超聲波輔助或加熱，以提高提取效率。
凈化: 通過固相萃?。⊿PE）、液-液萃取等方式去除雜質(zhì)，提高目標化合物純度。
濃縮與復(fù)溶: 使用氮吹或其他方法濃縮提取液，然后用流動相復(fù)溶，準備進樣。
2. 標準曲線制備
制備一系列不同濃度的有機酸標準溶液，用于建立標準曲線，以便后續(xù)定量分析。
3. 液相色譜分離
流動相選擇: 選擇適合目標有機酸的流動相，通常為水與有機溶劑（如甲醇、乙腈）的混合物，可能含酸性或堿性添加劑以改善分離。
色譜柱選擇: 根據(jù)有機酸的性質(zhì)選擇合適的色譜柱，如反相柱、離子交換柱等。
梯度洗脫: 設(shè)定適當?shù)奶荻认疵摮绦颍詢?yōu)化分離效果。
4. 質(zhì)譜檢測
電離源: 選擇電噴霧電離（ESI）或大氣壓化學電離（APCI）等電離方式，根據(jù)有機酸的性質(zhì)和檢測要求決定。
MS/MS掃描: 選定母離子進行碰撞誘導解離（CID），生成特征子離子，提高定性與定量的準確性。
數(shù)據(jù)采集: 設(shè)置質(zhì)譜參數(shù)，開始數(shù)據(jù)采集。
5. 數(shù)據(jù)分析
質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理: 使用專業(yè)軟件進行數(shù)據(jù)處理，包括峰識別、積分、同位素校正等。
定性與定量: 對比標準曲線，確定樣品中有機酸的種類及其濃度。
6. 結(jié)果驗證
重復(fù)性測試: 通過多次測量同一標準品，評估方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
回收率實驗: 通過添加已知量的標準品到樣品中，評估方法的回收率，確認方法的準確性。
整個過程需要嚴格控制實驗條件，確保數(shù)據(jù)的可靠性和準確性。此外，定期維護和校準儀器也是保證分析結(jié)果的關(guān)鍵。
提高有機酸的分離效果
液相色譜（HPLC）是一種常用的分析技術(shù)，用于分離和鑒定混合物中的各個組分。對于有機酸的分離，優(yōu)化HPLC條件尤為重要，因為有機酸的化學性質(zhì)決定了它們在色譜柱中的行為。以下是一些優(yōu)化HPLC條件以提高有機酸分離效果的建議：
選擇合適的色譜柱：反相色譜柱（如C18柱）通常用于有機酸的分離，但有時需要根據(jù)有機酸的性質(zhì)選擇不同的固定相材料，如親水相互作用色譜柱（HILIC）。
流動相的選擇：流動相的選擇對有機酸的分離效果有顯著影響。通常需要在流動相中添加適量的酸（如三氟乙酸）或緩沖鹽（如NaH2PO4）以增加有機酸的保留時間。此外，流動相的pH值也需要適當調(diào)整，以控制有機酸的電離狀態(tài)，從而影響其在色譜柱中的保留行為。
流速和溫度的優(yōu)化：流速和溫度的選擇會影響分析物在色譜柱中的遷移速度和分離效率。一般來說，較低的流速有助于提高分離度，而適宜的溫度則可以改善峰形和減少分析時間。
檢測波長的選擇：有機酸通常具有紫外吸收特性，因此選擇合適的檢測波長對于提高檢測靈敏度和選擇性至關(guān)重要。通常可以通過實驗確定最佳的檢測波長。
樣品前處理：適當?shù)臉悠非疤幚砜梢匀コ赡芨蓴_分析的雜質(zhì)，提高分析的準確性。例如，可以使用蛋白質(zhì)沉淀劑或固相萃取小柱來預(yù)處理樣品。
方法驗證：在優(yōu)化了HPLC條件之后，需要對方法進行驗證，確保其滿足預(yù)期的分離效果和分析目的。
常見質(zhì)譜模式
全掃描模式（Scan)
全掃描模式是最常用的掃描方式之一，它可以覆蓋被測化合物的分子離子和碎片離子的質(zhì)量范圍，得到化合物的全譜。這種模式適用于未知化合物的定性分析。
選擇離子監(jiān)測模式（SIM)
選擇離子監(jiān)測模式不是連續(xù)掃描某一質(zhì)量范圍，而是跳躍式地掃描某幾個選定的質(zhì)量，得到的不是化合物的全譜。主要用于目標化合物檢測和復(fù)雜混合物中雜質(zhì)的定量分析。
子離子掃描模式（Product Ion Scan)
子離子掃描模式在一級四極桿（Q1）固定掃描電壓選擇某一質(zhì)量離子進入后，二級四極桿（Q2）對這個選定的母離子進行裂解和全掃描，得到的是選定母離子的全譜。這種模式有助于分析化合物結(jié)構(gòu)。
母離子掃描模式（Precursor Ion Scan)
母離子掃描模式選擇母離子進入，經(jīng)Q2裂解后，Q3固定掃描，掃描電壓，檢測特定的離子，則該離子是由選擇的母離子產(chǎn)生的。得到的是能產(chǎn)生特定離子的母離子的譜圖。
中性丟失掃描模式（Neutral Loss Scan)
中性丟失掃描模式掃描所有離子，經(jīng)過Q2碎裂后，Q3與中性碎片的質(zhì)量差聯(lián)動掃描，檢測丟失該固定質(zhì)量的中性碎片。得到中性碎片譜，有助于分析同類化合物的結(jié)構(gòu)特征。
多重反應(yīng)監(jiān)測模式（Multiple Reaction Monitoring, MRM)
MRM模式選擇特定離子進入，經(jīng)Q2碎裂后，Q3仍檢測特定離子。只有符合特定條件的離子才能被檢測到。選擇性、專屬性更強，適用于定量分析。
