通過使用反相色譜柱，并根據(jù)不同維生素的性質(zhì)選擇合適的流動相和梯度洗脫程序，可以實現(xiàn)有效的分離。所得結(jié)果的重現(xiàn)性好，精密度高，加標回收率通常在85%～110%之間。
在實際應(yīng)用中，不同樣品的前處理對于色譜柱的保護和結(jié)果的準確性至關(guān)重要。例如，脂溶性維生素的樣品可能需要經(jīng)過皂化處理后提取至有機溶劑中，而水溶性維生素的樣品則可能需要經(jīng)過酶處理或酸堿處理以改善其在色譜柱中的分離效果。
此外，高效液相色譜法還可以實現(xiàn)維生素各個異構(gòu)體的很好分離，并且可以同時對多種維生素進行有效分析，大大提高了檢測效率。這使得HPLC在維生素檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。
工作原理
高效液相色譜法（HPLC）是一種用于分離、鑒定和定量液體樣本中的半揮發(fā)和不揮發(fā)化合物的分析技術(shù)。它的工作原理基于色譜法的分離原理，即不同物質(zhì)在固定相和流動相之間的分配平衡。在HPLC中，流動相是攜帶待測組分通過色譜柱的液體，而固定相則是色譜柱中的填料，它固定在色譜柱中并起到吸附和解析組分的作用。流動相和固定相的選擇對于HPLC的分離效果至關(guān)重要。
流程概述
1. 樣品前處理
樣品制備：首先需要對樣品進行適當?shù)奶幚恚缈s分、粉碎或均質(zhì)化，然后避光冷藏保存。
皂化：對于某些維生素，如維生素A和維生素E，需要進行皂化處理。這通常涉及將固體樣品或液體樣品與氫氧化鉀等堿性溶液反應(yīng)，以釋放出維生素。
提?。菏紫刃枰獙悠分械木S生素從其生物基質(zhì)中提取出來。這通常涉及到使用適當?shù)娜軇?，如乙醇、甲醇或水，有時還需要加入抗氧化劑以防止維生素降解。
凈化：提取液可能含有許多干擾物質(zhì)，因此需要通過固相萃?。?/span>Solid Phase Extraction, SPE）等方法進行凈化，以去除雜質(zhì)，提高維生素的純度。
濃縮與稀釋：根據(jù)檢測需要，可能需要對提取液進行濃縮或進一步稀釋，以達到合適的濃度范圍。
2. 樣品制備
過濾：使用0.45μm的濾膜過濾樣品溶液，以去除任何可能堵塞HPLC系統(tǒng)的顆粒物。
進樣：將處理后的樣品溶液轉(zhuǎn)移到HPLC的自動進樣器中，準備進行分析。
3. HPLC分析
選擇合適的色譜柱：根據(jù)目標維生素的性質(zhì)，選擇適合的反相或正相色譜柱。
設(shè)定流動相：流動相的選擇取決于目標維生素的極性和溶解性，通常包括水、甲醇、乙腈等，并可能添加酸、鹽或緩沖液來調(diào)整pH值和離子強度。
優(yōu)化色譜條件：包括流速、溫度、梯度洗脫程序等，以獲得最佳的分離效果。
檢測：使用紫外-可見光檢測器（UV-Vis）、熒光檢測器或電化學檢測器等，根據(jù)維生素的特性選擇最敏感的檢測方式。
4. 數(shù)據(jù)分析
峰識別：通過與標準品的保留時間對比，確認每個峰代表的維生素種類。
定量分析：使用外標法或內(nèi)標法，根據(jù)峰面積或峰高計算維生素的含量。
5. 結(jié)果驗證
重復(fù)性測試：多次測量同一樣品，評估方法的重復(fù)性和準確性。
回收率實驗：通過向已知含量的樣品中添加一定量的標準維生素，再進行檢測，計算回收率，驗證方法的可靠性。
注意事項
在整個過程中，應(yīng)嚴格控制實驗環(huán)境，避免維生素的氧化或降解。
每次分析前后，都要對色譜系統(tǒng)進行徹底清洗，以防止交叉污染。
根據(jù)具體維生素的性質(zhì)，可能需要調(diào)整上述流程中的某些步驟，例如使用特定的前處理方法或檢測條件。
根據(jù)維生素的性質(zhì)選擇合適的流動相和梯度洗脫程序
選擇合適的流動相
流動相的選擇對于維生素的分離效果至關(guān)重要。對于水溶性維生素，通常選擇含有一定比例的水和有機溶劑（如甲醇或乙腈）的混合溶液作為流動相。例如，在分析維生素C時，可以使用0.1 mol·L^-1醋酸鈉溶液和甲醇的混合溶液作為流動相。對于脂溶性維生素，流動相通常包含更高比例的有機溶劑，以增強其在流動相中的溶解度。
設(shè)計梯度洗脫程序
梯度洗脫程序是通過改變流動相的組成比例，從而實現(xiàn)不同維生素的有效分離。梯度洗脫程序通常包括起始條件、梯度變化階段和終止條件。例如，在分析復(fù)合維生素注射液中的11種維生素時，可以采用以下梯度洗脫程序：起始時流動相為95%醋酸鈉溶液和5%甲醇，經(jīng)過一段時間后逐漸減少醋酸鈉溶液的比例，增加甲醇的比例，直至全部為甲醇，然后再恢復(fù)到起始條件。
注意事項
在設(shè)計流動相和梯度洗脫程序時，需要考慮維生素的化學性質(zhì)、穩(wěn)定性以及色譜柱的特性。此外，還需要根據(jù)實際樣品的復(fù)雜程度和分析目的來調(diào)整流動相的組成和梯度洗脫的細節(jié)。在實驗過程中，可能需要多次優(yōu)化才能獲得滿意的分離效果。
技術(shù)優(yōu)勢
高速分析：HPLC的分析速度快，通常可以在幾分鐘到幾十分鐘內(nèi)完成分析，這對于需要快速得到結(jié)果的場合非常適用。
高分辨率：HPLC能夠有效地將復(fù)雜混合物中的各個組分進行分離，尤其是對于分子量相近、結(jié)構(gòu)相似的化合物，HPLC展現(xiàn)出良好的分離能力。
高靈敏度：HPLC的檢測器如紫外-可見光檢測器、熒光檢測器等具有非常高的靈敏度，能夠檢測到非常低濃度的樣品組分。
廣泛的適用性：HPLC幾乎可以用于所有可溶性的有機化合物的分析，包括高沸點、不易揮發(fā)的、熱穩(wěn)定性差的以及具有生理活性的物質(zhì)。
重復(fù)性好：HPLC系統(tǒng)具有高度的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，只要操作條件控制得當，多次分析同一樣品時，色譜圖幾乎相同。
自動化程度高：現(xiàn)代的HPLC系統(tǒng)已經(jīng)高度自動化，包括自動進樣、自動梯度洗脫、自動數(shù)據(jù)處理等功能，大大減輕了操作人員的勞動強度，提高了分析效率。
樣品消耗少：HPLC的進樣量通常很小，一般在幾微升到幾十微升之間，這對于珍貴樣品的分析尤為重要。
柱后衍生化：HPLC系統(tǒng)可以與柱后衍生化技術(shù)結(jié)合，對不易檢測的化合物進行衍生化，轉(zhuǎn)化為易于檢測的化合物，從而擴大了HPLC的檢測范圍。
